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本文为了阐明胖、瘦如何影响肠道菌群的问题，收集单卵、双卵双胞胎的成年女性，以及她们的母亲的粪便样本，利用了二代高通量测序技术进行了16S rRNA测序。分析了154个人的9920条近全长的16S rRNA序列和1937461条16SrRNA的序列部分，和2.14G的微生物基因组的数据后，本文发现家庭成员共享肠道菌群，但每个人在单独的肠道菌群中有所不同，与此同时，成年单卵、双卵双胞胎间菌群共同变异的程度相当。在每人不同肠道菌群海量数据基础上，依然找了“核心菌群”。胖、瘦与“核心菌群”的门级变化、“核心菌群”多样性降低以及“核心菌群”基因、代谢途径表达的改变这四个因素直接相关。
实验方法总结
收集154个人的粪便样本。制备DNA，以用于454生命科学的二代高通量测序和16S rRNA基因的PCR反应和测序。使用以下5个数据：NCBI Non-redundant、KEGG、STRING、CAZY、44人肠道菌群基因组数据库，将Reads映射到参考基因组。注释以下3个数据库CAZy、KEGG和STRING用来重构代谢。相对丰度的KEGG代谢通路被作为“代谢谱”。
实验结果
我们研究了31对单卵（MZ）双胞胎、23对双卵（DZ）双胞胎及其母亲（n=46）的肠道微生物群落。进行了单卵双胞胎配对、双卵双胞胎配对、父母-后代配对的方案，用来评估基因型、早期环境共享这两个因素对肠道菌群的影响。此外，可重复的方式因过度喂养而增加体重9对遗传上“相同”的单卵双胞胎、双卵双胞胎、无亲缘关系的人，单卵双胞胎BMI体重指数的增加最一致，DZ双胞胎次之、无亲缘关系的人最不一致。
本研究招募了密苏里州青少年女性双胞胎研究（MOAFTS）的双胞胎对（MOAFTS的平均注册期为11.7±1.2年；范围为4.4–13.0年）。所有双胞胎年龄均为25-32岁，具有欧洲或非洲血统（分别为EA和AA），通常与肥胖（BMI≥30 kg/m2）或消瘦（BMI=18.5–24.9 kg/m2）[1对双胞胎为消瘦/超重（超重定义为BMI≥25和<30），6对超重/肥胖]，且至少5.49±0.09个月未服用抗生素。每个参与者都完成了一份详细的医疗、生活方式和饮食问卷：他们在体重指数、生育率、教育程度和军事状况方面广泛代表了密苏里州的总体人口（见补充结果）。尽管所有人都出生在密苏里州，但他们目前居住在美国各地：29%的人住在同一栋房子里，但有些人居住的距离超过800公里。由于粪便样本很容易获得，并且代表了肠道微生物生态学中的人际差异，因此从每个人身上收集粪便样本并立即冷冻。再次重复采集程序，平均采样间隔为57±4天。
为了研究这154个人粪便微生物群中存在的细菌谱系，我们用ABI 3730xl毛细管测序仪对全长基因进行了16S rRNA测序。此外，我们使用454 FLX仪器进行多重焦测序，以调查基因的V2可变区和V6高变区。
使用互补的系统发育和分类法比较粪便群落中的16S rRNA序列（见方法）。无论检查基因的哪个区域，来自同一家族的个体（双胞胎及其同卵双胞胎，或双胞胎及其母亲）的细菌群落结构都比不相关的个体更相似（图1A和补充图1A，B），并且共享明显更多的物种级门型（定义为共享≥其16S rRNA序列的同源性为97%）[G=55.2，p<10?12（V2）；G=12.3，p<0.001（V6）；G=11.3，p<0.001（全长）]。家庭成员当前家庭的物理分离程度与其微生物群落之间的相似程度（由UniFrac定义）之间没有显著相关性。观察到的家族相似性不是由于肥胖与消瘦的生理状态的间接影响；通过BMI分类对双胞胎及其母亲进行分层后，观察到了类似的结果（一致的瘦或一致的肥胖个体；补充图2）。令人惊讶的是，成人MZ与DZ双胞胎的肠道微生物群相似程度没有显著差异（图1A）。然而，在本研究中，我们无法评估MZ和DZ双胞胎在其生命早期是否有不同程度的相似性。
与一代测序相比，V2和V6扩增子的多重焦测序允许更高水平的覆盖，平均每个样本达到3984±232（V2）和24786±1403（V6）序列。为了控制覆盖率的差异，所有分析均在相同数量的随机选择序列上进行 [200个全长、1000个V2和10000个V6] 。在这一覆盖水平上，采样的粪便群落之间几乎没有重叠。此外，粪便微生物群中属于每个门的16S rRNA基因序列的数量差异很大（补充表6-8）。
由于这种明显的重叠缺失可能反映了覆盖水平（补充表1-3），我们随后使用基于标准泊松和二项抽样统计组合的抽样模型搜索了所有宿主中存在高丰度的细菌门型。通过分析，我们可以得出结论，在本研究的所有样本中，没有任何种类的丰度超过0.5%（见补充结果）。最后，我们通过随机选择50–3000个序列/样本对数据集进行二次采样；同样，在该覆盖范围内采样的所有个体中均未检测到任何门型（补充图3）。
在最初采集点和57±4天后从同一个人身上采集的样本与发现的特定菌门一致（补充图4、5），但主要肠道细菌门的相对丰度存在差异（补充图6）。UniFrac距离与样本采集时间之间没有显著关联。总体而言，来自同一个人的粪便样本比来自家庭成员或无关个人的样本更相似（图1A），表明与个人间差异相比，个人内社区结构的短期时间变化较小。
对三种基于PCR的方法产生的16S rRNA数据集进行分析，再加上DNA的shotgun测序（见下文），结果显示，与瘦EA和AA个体相比，肥胖个体中的拟杆菌属比例较低，放线菌属比例较高（补充表9）。使用Fisher方法结合这些独立分析中的单个p值，发现拟杆菌明显较少（p=0.003），放线菌较多（p=0.002），但厚壁菌无显著差异（p=0.09）。这些发现与先前的研究一致，即当12名不相关的肥胖人在摄入两种低热量饮食中的一种后体重减轻时，小鼠的两种分类群的差异相当，拟杆菌属的代表性逐渐增加。
在所有方法中，肥胖与多样性水平的显著降低相关（图1B和补充图1C–F）。这种多样性的减少表明了一个类比：肥胖的肠道微生物群不像雨林或珊瑚礁，它们适应高能量通量，高度多样性，而可能更像肥料径流，其中多样性减少的微生物群落在异常能量输入下开花。
随后，我们通过shotgunpyrosequencing测序（补充表4、5）和BLASTX比对多个数据库[KEGG和STRING]以及一个自定义数据库，对代表6个家族的18个个体（3个瘦EA-MZ双胞胎对及其母亲加上3个肥胖EA-MZ双对及其母亲）的粪便微生物群的微生物谱系和基因含量进行研究44个参考人类肠道微生物基因组（补充图7-10和补充结果）。我们的分析参数使用由KEGG数据库中注释的随机片段微生物基因组成的对照数据集进行了验证（补充图11和补充方法）。我们还测试了产生更长读数的技术进步如何通过使用Titanium pyrosequencing方法对一对双胞胎的粪便群落样本进行测序来改善这些分配[平均读数长度为341±134 nt（SD），而标准FLX方法为208±68 nt]。补充图12显示，序列分配的频率和质量随着读取长度从200 nt增加到350 nt而提高。
搜索18个微生物组，以确定与实验验证的碳水化合物活性酶组（CAZymes）的结构域相匹配的序列。在至少一个人体肠道微生物组中发现了与156个总CAZy家族相匹配的序列，包括77个糖苷水解酶、21个碳水化合物结合模块、35个糖基转移酶、12个多糖裂解酶和11个碳水化合物酯酶家族（补充表10）。平均而言，肠道微生物组中2.62±0.13%的序列可归属于CAZymes（共217615个序列），这一比例大于最丰富的KEGG途径（“转运蛋白”；1.20±0.06%的每个样本产生的过滤序列），并表明大量多样的微生物基因可用于获取广泛的多糖。
使用主成分分析（PCA）和分层聚类对每个微生物组的功能进行了基于类别的聚类。根据代谢概况，确定了两个不同的肠道微生物组群，分别对应于厚壁菌门和放线菌门丰度增加的样本和拟杆菌门丰度高的样本（图2A）。第一主成分（PC1，解释了20%的函数方差）和拟杆菌属相对丰度的线性回归显示出高度显著的相关性（R2=0.96，p<10?12; 图2B）。在积累了约20000个序列后，每个个体的微生物组内的功能分布稳定（补充图13）。家庭成员比无关个体具有更多相似的特征（图2C），这表明共享的细菌群落结构（基于16S rRNA分析）也转化为共享的全社区代谢途径的相对丰度。因此，功能和分类相似性的直接比较（见补充方法）揭示了一个重要的关联：具有相似分类特征的个体也具有相似的代谢特征（p<0.001；Mantel检验）。
代表分配给23个人类肠道厚壁菌门和14个拟杆菌门参考基因组的微生物组读数的全门序列箱的功能聚类显示了按门的离散聚类（补充图14A，15）。对微生物组来源的厚壁菌门和拟杆菌门序列库中代谢途径相对丰度的Bootstrap分析揭示了具有显著不同相对丰度的26条途径（补充图14A）。拟杆菌门富含多种碳水化合物代谢途径，而厚壁菌门富含运输系统。该发现与我们的CAZyme分析一致，该分析揭示了拟杆菌序列库中糖苷水解酶、碳水化合物结合模块、糖基转移酶、多糖裂解酶和碳水化合物酯酶的相对丰度显著较高（补充图14B）。
国际人类微生物组项目的主要目标之一是确定在所有或绝大多数人类的特定身体栖息地中是否存在可识别的共享生物、基因或功能能力的“核心微生物组”。尽管所调查的18个肠道微生物组中，相对于细菌门的相对丰度，对广泛功能类别基因（COG）和代谢途径（KEGG）的相对丰度的分析揭示了一个总体一致的模式，无论调查的样本如何（图3B和补充表11）：该模式也与我们从先前发表的9个成人肠道微生物组数据集的荟萃分析中获得的结果一致（补充图16）。这种一致性不仅仅是由于这些注释的广泛程度，因为对拟杆菌门和厚壁菌门参考基因组的类似分析揭示了每个类别的相对丰度的显著差异（参见补充图17）。此外，本研究中从18个微生物组获得的代谢谱的成对比较显示平均R2为0.97±0.002（图2A），表明功能相似性较高。
使用Shannon index对总体功能多样性进行了比较，Shannon index结合了多样性（不同类型代谢途径的数量）和均匀性（每个途径的相对丰度）。所调查的人体肠道微生物组具有稳定且高的Shannon指数值（4.63±0.01），接近功能多样性的最大可能水平（5.54；见补充方法）。尽管存在少量丰富的代谢途径（列于补充表11），但每个肠道微生物组的总体功能分布相当均匀（香农均匀度为0.84±0.001，比例为0至1），表明大多数代谢途径的丰度水平相似。有趣的是，每个微生物组的功能多样性水平与拟杆菌的相对丰度显著相关（R2=0.81，p<10?6); 富含厚壁菌门/放线菌的微生物群具有较低水平的功能多样性。这一观察结果与对36个拟杆菌属和厚壁菌属基因组中每一个产生的模拟宏基因组读数的分析一致（补充图18）：平均而言，拟杆菌属基因组具有显著更高的功能多样性和均匀性水平（Mann-Whitney，p<0.01）。
在更精细的水平上，26-53%的“酶”级功能组（KEGG/CAZy/STRING）在所有18个微生物组中共享，而8-22%的功能组是单个微生物组独有的（补充图19A–C）。所有微生物组中存在的“核心” 功能组也非常丰富，占总序列的93–98%。鉴于这些“核心”组的相对丰度较高，在从给定的微生物组中采集26.11±2.02 Mb序列后，发现>95%，而“可变”组随着每增加一Mb序列继续显著增加。当然，对核心微生物组总大小的任何估计都将取决于测序工作，特别是对于低丰度的功能组。平均而言，我们的调查每个粪便样本获得了450000多个序列，假设分布均匀，这将允许我们对相对丰度为10?4.为了估计基于18个个体的核心微生物组的总大小，我们在1000个序列间隔内对每个微生物组进行了随机亚采样（补充图19D）。基于这一分析，核心微生物组接近总共2142个同源组（一个位点结合双曲线曲线与所得到的稀疏曲线拟合，R2=0.9966），表明我们已识别出18个受调查个体的核心微生物组中发现的93%的功能组（由STRING定义）。在这些核心组中，71%（CAZy）、64%（KEGG）和56%（STRING）也出现在之前发表的9个由成人粪便DNA毛细管测序生成的覆盖率低得多的数据集中（平均78413±2044个双向读数/样本；见补充方法）。
“核心”微生物组的代谢重建揭示了许多预期功能类别的显著富集，包括参与转录和翻译的功能类别（图4）。基于代谢谱的聚类表明，“核心”功能组的表达在样本中高度一致（补充图20），并包括许多可能对肠道生活很重要的途径，如碳水化合物和氨基酸代谢（如果糖/甘露糖代谢、氨基糖代谢和N-甘氨酸降解）。可变代表的途径和类别包括细胞运动（只有厚壁菌门的一部分产生鞭毛）、分泌系统和膜运输（例如，参与营养物质（包括糖）输入的磷酸转移酶系统；图4和补充图20）。
比较了每对微生物组中CAZy糖苷水解酶和糖基转移酶家族的分布（相对丰度>1%的CAZy家族见补充表10）。该分析表明，所有个体的糖基转移酶谱都相似（R2=0.96±0.003），而糖苷水解酶谱的变异性更大，即使在家族成员之间也是如此（R2=0.80±0.01；p<10?30，配对学生t检验）。这表明糖苷水解酶的数量和光谱可能比糖基转移酶更受饮食等“外部”因素的影响。
为了确定与肥胖相关的代谢途径，在比较瘦双胞胎和肥胖双胞胎的肠道微生物组时，只包括非核心相关（可变）功能组。自举分析用于确定在可变肥胖肠道微生物组中富集或耗竭的代谢途径。例如，与饮食诱导肥胖的小鼠模型相似，肥胖的人体肠道微生物组富含参与碳水化合物微生物加工的磷酸转移酶系统（补充表12）。将所有肠道微生物组序列与44个人类肠道基因组的定制数据库进行比较：优势比分析显示，肥胖和瘦肠道微生物组之间有383个基因显著不同（q值<0.05；肥胖微生物组中273个基因富集，110个基因缺失；补充表13、14）。相比之下，只有49个基因在所有双胞胎中持续富集或缺失（见补充方法）。
这些肥胖相关基因代表了上述的分类差异：75%的肥胖富集基因来自放线菌（与0%的贫富集基因相比，其余25%来自厚壁菌门），而42%的贫富集的基因来自拟杆菌门（与0%肥胖富集基因相比）。他们的功能注释表明，许多参与碳水化合物、脂质和氨基酸代谢（补充表13、14）。它们共同构成了肥胖肠道微生物组的一组初始微生物生物标志物。
我们发现，成年MZ双胞胎对的肠道微生物群落结构与DZ双胞胎对的相似程度相当，与母亲相比仅略为相似，这与早期对成年双胞胎的指纹研究以及最近基于微阵列的分析一致，这表明，与12个不相关的婴儿相比，一对DZ双胞胎在出生后第一年的肠道群落聚集遵循更为相似的模式。有趣的是，另一项对MZ和DZ双胞胎儿童的指纹研究显示，DZ双胞胎的相似性略有降低，以及对其家族微生物群的代际分析，将是确定宿主基因型和环境暴露对（肠道）微生物生态的相对贡献的关键。
假设有一个核心的人类肠道微生物组，可以由我们共同拥有的一组丰富的微生物-生物谱系来定义，这一假设可能是错误的：到成年时，在所有154个采样的人类的肠道中，没有一个单一的细菌门型以丰富的频率被检测到。相反，似乎核心肠道微生物组存在于代谢功能水平。这种保护表明肠道微生物组存在高度冗余，并支持将每个个体视为“岛屿”的生态观点，“岛屿”上居住着独特的微生物种类群：与实际岛屿一样，不同的物种组合汇聚在由不同组成部分提供的共享核心功能上。我们的发现提出了一个问题，即核心功能是如何在这个身体栖息地中组装的。了解这些基本原理应该能提供关于微生物适应各种环境的见解，也许还可以提供在大范围环境中的互惠共生的群落集合。
英文原文：
Turnbaugh PJ, Hamady M, Yatsunenko T,Cantarel BL, Duncan A, Ley RE, Sogin ML, Jones WJ, Roe BA, Affourtit JP, EgholmM, Henrissat B, Heath AC, Knight R, Gordon JI. A core gut microbiome in obeseand lean twins. Nature. 2009 Jan 22;457(7228):480-4. doi: 10.1038/nature07540.Epub 2008 Nov 30. PMID: 19043404; PMCID: PMC2677729.