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检测细胞凋亡和细胞周期步骤的介绍

Apoptosis

  • 为程序性细胞死亡,起因可能因为外界环境、生长发育等因素而导致自然死亡现象。当细胞发生apoptosis时,会发生细胞膜PS由内外翻至细胞外、线粒体膜电位改变、Caspase活化。DNA fragmentation,一连串的反应使细胞裂解形成凋亡小体,被巨噬细胞识别并清除。

检测方法

Step 1:Annexin V binding assay / 细胞膜 PS 外翻

  • 凋亡细胞在早期Phosphatidyl-serine(PS)会由细胞膜内外翻至膜外,利用Annexin V检测能让您作为最快速方便的apoptosis指示:
    1.只需15分钟,让您快速检测早期apoptosis指示
    2.无须固定,活细胞即可检测
    3.可利用Flow cytometry或immunofiuorescence分析结果
    4.选择性多,可搭配Kit或是抗体


    检测细胞凋亡和细胞周期步骤的介绍,第1张

    检测细胞凋亡和细胞周期步骤的介绍,第2张

Annexin V binding assay / 细胞膜 PS 外翻原理

  • 以Annexin V-FITC标示外翻的PS,再合并以PI进行的死亡细胞的染色,以区分三种细胞。凋亡细胞可被Annexin V-FITC染成绿色,但对PI拒染;已死亡或Apoptosis后期的细胞因细胞膜已破损会同时染上Annexin V-FITC与PI;健康的细胞则无法染上Annexin V-FITC或PI。

protocol

检测细胞凋亡和细胞周期步骤的介绍,第3张

注意事项

Tips:

    1. 由于凋亡检测的为活细胞,因此整个收集细胞的操作过程尽量保持细胞活性,避免人为的损伤细胞,如:避免用力吹打细胞,避免胰酶消化时间过长,用冰浴的PBS清洗细胞,缩短上机检测的时间。
    1. Annexin-V染料上带FITC荧光,因此从染色开始注意避光操作和孵育,一般尽量在染色后半个小时内上机检测。
    1. 如果处理的细胞中含有GFP会干扰FITC的荧光信号,应该更换不同波长的荧光染料标记的Annexin-V。
    1. 如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin-V结合,从而干扰实验结果。
    1. 在消化液中尽量不用EDTA,EDTA会影响Annexin V 与PS的结合,若胞内已转染GFP,建议使用AnnexinV-PE。

参考网址:http://blog.sina.com.cn/s/blog_73a963ea0102whu2.html

细胞周期检测

原理

PI法是经典的周期检测方法。PI为插入性核酸荧光染料,能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合,其结合的量与DNA的含量成正比例关系,用流式细胞仪进行分析,就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态,从而计算出各个期的百分含量。PI染色后,假设G0/G1期细胞的荧光强度为1,那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2,正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。


检测细胞凋亡和细胞周期步骤的介绍,第4张

protocol

  1. 细胞培养:六孔板种下细胞,每孔1.5*10^6个,细胞处于生长对数期,50-80%贴壁后换含药培养液(三复孔),处理相应时间后,收细胞检测(单次流式细胞仪检测,1份样品细胞数量约10e6)
  2. 细胞处理:胰酶消化含血清培养基中和,2000 rpm * 5 min,用预冷PBS重悬洗涤,小心地吸去上清,残留约50ul,不要倾倒;
  3. 细胞固定:1ml PBS充分重悬,成单细胞,轻轻边vortex,边缓慢滴加3ml预冷的无水乙醇,至终浓度75%,4度静置过夜(18-24h),-20度长期保存一个月(预约流式细胞仪)
  4. 将过夜固定好的细胞用预冷PBS 洗两次,2000rpm 5min去除 PBS 后加入200 ul PBS(约400ul),为减少细胞损失可用1.5ml离心。移至1.5ml EP管中, 轻轻弹击离心管底,以适当分散细胞,避免细胞成团。加入20 μLRNase(储存浓度25 mg/mL,PBS 稀释成1mg/ml,工作浓度50ug/ml),重悬细胞,37 ℃水浴消化 30 min;加入PI 20ul至终浓度50ug/ml(储存液浓度25mg/ml, PBS稀释1mg/ml加入10ul)锡箔纸包住,避光4度染色30min,24h内上机检测。充分混匀细胞,用 200 目滤网过滤后,便可利用流式细胞仪进行细胞周期。
  5. 数据的收集和分析
    流式检测和分析:用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光,同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。
    Viable cell---PI阴性Annexin V阴性细胞
    Early apoptotic cell ---PI阴性Annexin V阳性细胞
    Dead---PI阳性Annexin V阳性细胞

参见:流式联盟,医福会


https://www.xamrdz.com/lan/55q2016728.html

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