这篇文章于2023年6月发表于The Journal of Clinical Investigation（IF=15.9，Monocyte-derived macrophages orchestrate multiple cell-type interactions to repair necrotic liver lesions in disease models），主要探究了参与肝损伤修复的细胞及其具体机制，作者寻找新功能相关细胞群体的推导和验证过程值得学习借鉴。
研究意义：肝脏具有极强的自我再生能力。肝脏部分切除和其它急性肝损伤模型常用于肝脏再生的相关研究，由于后者能诱发人类肝脏疾病（病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、自体免疫肝病和药物引起的肝损伤等）进展过程里常见的组织坏死，因此是更加理想的研究模型。虽然多种肝脏疾病会诱发组织坏死，但坏死组织消融和修复的机制未知。
炎症会使肝损伤恶化，同时又促进肝损伤修复和纤维化消融。本文作者用注射T细胞丝裂原concanavalin A (ConA) 探究肝损伤修复过程免疫细胞消融和修复坏死组织的机制。已知注射ConA后，肝脏会出现大量组织坏死，且坏死组织在数天内消融修复，但其机制未知。作者的预实验结果显示，单核细胞来源的巨噬细胞（MoMFs）是包裹坏死组织的主要细胞。正常肝组织主要含驻留的巨噬细胞Kupffer细胞，只有少量MoMFs。但肝损伤发生后，大量MoMFs通过CCL-2-CCR2受配体对浸润到肝脏。已知Kupffer细胞和MoMFs在加重局部炎症的同时，亦促进组织修复。之前的研究主要集中在浸润MoMFs免疫和吞噬功能改变，对其促进坏死组织消融和修复的研究较少。
研究策略： 作者以“肝损伤诱发的肝组织坏死消融和修复机制”为科学问题，利用多个转基因小鼠和腺病毒介导的组织特异性基因敲除，以及免疫组化、免疫荧光等实验技术系统性地探讨了参与肝损伤组织修复的细胞组分和来源，以及各组分细胞促进组织修复的机制，最后再结合其它肝损伤模型验证自己理论模型的普适性。
研究方法：
1、MoMFs are aggregated and encapsulate the necrotic lesions following immune-mediated liver injury.
用ConA诱导小鼠发生肝组织坏死发现，坏死组织修复过程中会出现一群包裹坏死组织的CD45+免疫细胞，可将坏死组织和正常组织分割开来（图1A）。分析包裹细胞成分显示，MoMFs（IBA1+CLEC4F–：IBA1为巨噬细胞marker，CLEC4F为Kupffer细胞marker）从24h开始出现并逐渐增加，使用GFP+骨髓细胞进行移植实验显示，包裹坏死组织的细胞是骨髓来源的MoMFs（图1B-C）。活化肝星状细胞（aHSCs，Desmin+α-SMA+）和中性粒细胞（MPO+）主要出现在后期（72-96h，图1B）。Kupffer细胞主要位于未损伤组织，表明它们在肝损伤时被破坏，而且正常组织的Kupffer细胞不会迁移到坏死组织（图1B）。Kupffer细胞通过分泌促炎因子诱发ConA引起的肝损伤，检测发现，Kupffer活化和吞噬功能相关标志物表达在ConA注射6h后增加，随后不再发生显著改变（图1D）。用Ccr2-/-、Cx3cr1-/-和Ccl2Hep-/-小鼠探究肝损伤募集MoMFs机制结果显示，包裹坏死组织的肝细胞通过分泌CCL2募集MoMFs，敲除Ccr2能显著抑制MoMFs向坏死组织浸润，但对Kupffer细胞没有显著影响（图1E-G）。因此，骨髓来源的MoMFs在肝损伤后被募集到坏死组织并将其包裹。
2、MoMFs trigger the formation of a cell death–resistant SOX9+hepatocyte layer encapsulating the necrotic areas via the JAG1/NOTCH2 pathway at early time points.
SOX9是肝祖细胞（LPCs）和胆管上皮细胞的特异性marker，激活NOTCH信号通路可以调控其表达，从而调控成肝细胞向胆管细胞（BDCs）分化。结果显示，正常肝脏仅BDCs表达SOX9，但肝损伤组织的BDCs和包裹坏死组织的细胞在损伤后48-72h均表达SOX9（图2A-B，原文将SOX9和肝细胞、LPCs以及BDCs的特异性marker进行了共染，仅肝细胞和BDCs与SOX9存在共定位）。由于MoMFs和SOX9+肝细胞共定位，作者在注射ConA 8h后清除小鼠巨噬细胞，结果显示，SOX9+肝细胞显著减少（图2B-C）。此外，敲除CCR2同样使SOX9+肝细胞显著减少，但敲除CX3CR1对其没有影响（图2D）。接着，作者对SOX9表达调控机制进行探究。分选MoMFs并对能诱导SOX9表达的因子进行检测，NOTCH信号通路的配体JAG1在ConA处理后显著增加，且NOTCH信号通路其它靶基因表达显著增加（图2E）。JAG1高表达在坏死包裹区免疫细胞和ConA处理小鼠SOX9+肝细胞周围，在没有损伤肝脏组织里的表达极弱（图2F）。用RFP标记小鼠CCR2并注射ConA，结果显示，RFP与CCR2有显著共表达，且注射ConA后共表达细胞比例增加（图2G）。随后，作者用JAG1受体敲除小鼠进行验证，敲除小鼠JAG1受体显著降低SOX9+肝细胞数量（图2H）。因此，MoMFs通过JAG1/NOTCH信号通路诱导SOX9+肝细胞生成并包裹坏死区。
3、SOX9+hepatocytes are derived from mature hepatocytes and limit liver injury by activating survival signaling without contributing to hepatocyte proliferation.
接着作者用Sox9 CreERTRosa26-EYFP报告小鼠对SOX9+肝细胞来源进行追溯（该示踪小鼠能让70%的CK19+表达EYFP，CK19+主要表达在BDCs、LPCs以及部分门静脉周围肝细胞）。注射ConA产生的SOX9+肝细胞不表达EYFP蛋白（图3A）。作者接着用 AAV-TBG-Cre+Rosa-EYFP报告小鼠进行追溯（标记肝细胞）。注射ConA产生的SOX9+肝细胞表达EYFP蛋白（图3B）。虽然有报道指出门静脉周围SOX9+肝细胞有更强的再生能力，但注射ConA产生的SOX9+肝细胞没有增殖能力（图3C）。相反，未损伤肝组织存在大量增殖活跃的肝细胞，表明SOX9-而非SOX9+肝细胞是替代坏死组织的主要肝细胞来源（图3C）。接着作者探究了SOX9对坏死组织的影响。利用AAV8-TBG-Cre特异性敲除肝细胞的SOX9并注射ConA发现，敲除SOX9显著扩大坏死区，肝细胞增殖显著减少，血液ALT水平和小鼠死亡率显著升高（图3D-F）。SOX9如何影响肝细胞存活呢？作者检测了STAT3磷酸化和BCL-xL两个抗凋亡蛋白表达。包裹坏死区的SOX9+肝细胞表达pSTAT3和BCL-xL，敲除SOX9或者其上游NOTCH2则阻滞其表达（图3G-H）。因此，SOX9+肝细胞来源于成熟肝细胞，它高表达抗凋亡蛋白因而具有很强的抗凋亡能力，从而抑制肝脏组织坏死。
4、aHSCs encapsulate the necrotic areas with strong cell contraction signal activation during the resolution phase to promote necrotic area resolution which is induced by MoMFs.
aHSCs和MoMFs是包裹坏死区的主要细胞，desmin+HSC表达高水平的α-SMA和BrdU，表明肝损伤后HSCs开始增殖且活化（图4A）。此外，aHSCs（α-SMA+desmin+）高表达与收缩功能相关的活化YAP以及pMLC（图4B）。通过激活pMLC引起HSCs收缩的ECE1蛋白在包裹区表达显著增加，且坏死后期与MoMFs存在显著共定位（图4C）。那么aHSC的产生是否与MoMFs有关？敲除小鼠的CCR2使α-SMA+HSCs（aHSCs）显著减少，但敲除CX3CR1则没有影响（图4D）。用clodronate去除MoMF显著抑制坏死组织修复（图4E-F）。因此，MoMFs和aHSCs组成的包裹结构对肝损伤修复非常重要，且MoMFs对aHSCs产生至关重要。
5、Identification of 2 clusters of necrosis-associated MoMF populations by scRNA-Seq, including C1q+ MoMFs and Pdgfb+ MoMFs, and hypoxia-driven C1q+ MoMFs facilitate dead cell removal and promote liver lesion repair.
用单细胞测序对包裹坏死区的MoMFs亚群进行分析，结果显示有两群MoMFs细胞在处理后显著增加（C1q+MoMFs和Pdgfb+MoMFs，图5A）。C1q的主要功能是清除死细胞，Pdgfb的主要功能是促进HSCs生长和活化。作者对这两群细胞的功能进行了验证。因为C1q+MoMFs细胞表达C1q和Ctsb这些补体和蛋白酶，作者构建了C1q-/-小鼠/用Ctsb抑制剂处理小鼠。敲除Clq/抑制Ctsb显著抑制坏死组织的修复（图5B）。坏死区通常处于缺氧状态，作者探究了缺氧与C1q+MoMFs形成的关系。结果显示，MoMFs和坏死区的其它细胞均处于缺氧状态，MoMFs的HIF1α（低氧激活的转录因子）显著活化，但未损伤区Kupffer细胞的HIF1α却未被激活（图5C）。构建髓系细胞特异性敲除HIF1a（Hif1amye-/-）的小鼠并注射ConA发现，除了其经典下游CTSB和ECE1表达显著减少外，C1q、LGMN和MAFB（C1q上游分子）表达均显著下调（图5D）。用死肝细胞和/或HIF激动剂处理巨噬细胞，上述两个细胞亚群的大部分特征基因表达显著上调（图5E）。此外，HIF1a敲除的MoMFs吞噬能力显著下降，且髓系细胞特异性敲除HIF1a小鼠其肝坏死组织的修复显著减慢（图5F-G）。因此，作者验证出C1q+MoMFs和Pdgfb+MoMFs两个MoMFs亚群细胞参与肝坏死组织的修复，C1q+MoMFs的出现与组织缺氧有关，可以促进死细胞清除和组织修复。
6、PDGFB derived from MoMFs in necrotic area promotes HSC activation and contraction, thereby accelerating liver lesion resolution.
接下来，作者对Pdgfb+MoMFs的功能进行了探讨。Pdgfb+MoMFs表达高水平的PDGFB，而PDGF可以通过PDGFR激活HSCs。作者构建了特异性敲除髓系细胞PDGFB（Pdgfbmye-/-）以及HSC的PDGFRA（PdgfraHSC-/-）小鼠。敲除小鼠包裹坏死组织的结构中与MoMFs共定位的aHSCs显著减少，Desmin+BrdU+的HSCs显著减少（图6A-B）。Pdgfbmye-/-和PdgfraHSC-/-小鼠注射ConA后，坏死区面积显著增加（图6C）。此外，Hif1amye-/-小鼠的PDGFb表达减少，表明低氧调控PDGFb表达（图6D）。因此，Pdgfb+MoMFs可以激活HSCs，从而促进组织修复。
7、Aggregation of IBA1+MoMFs, SOX9+hepatocytes, and α-SMA+HSCs surrounding necrotic lesions is also detected in other liver-injury models.
为了证明“IBA+MoMF、SOX9+肝细胞和aHSCs相互作用促进肝损伤修复”的普适性，作者用肺炎克雷伯菌感染、缺血/再灌注以及具有肝脏毒性的药物（CCl4和APAP）构建了肝损伤模型。肺炎克雷伯菌感染和缺血/再灌注诱发的肝损伤能观察到明显的IBA+MoMF、SOX9+肝细胞和aHSCs在坏死组织包裹区聚集，但CCl4和APAP却没有这个现象，作者推测是因为这类药物主要靶向肝细胞，因而有不同的修复机制。因此，“IBA+MoMF、SOX9+肝细胞和aHSCs促进肝损伤修复”这一机制具有普适性。
Take-home message：
本文紧扣“肝损伤组织的快速消融和修复机制”，构建了大量敲除和示踪转基因小鼠，结合大量的免疫组化/免疫荧光等染色技术，在体内水平全面而确凿的为自己的观点提供了论据。从其模型动物的使用，以及对肝损伤修复过程参与细胞的推理可以看出，该课题组在此方向深耕多年（详情见Bin Gao老师简历页https://irp.nih.gov/pi/bin-gao）。虽然实验技术的使用略显单调且很常见，但“好的科学问题+可信度高的实验模型+“言简意赅”的实验技术验证“所得出的实验结果却是最直接、可信度最高的。当然，能被选为JCI杂志的封面文章，充分体现了其发现的新颖性，以及对肝损伤修复相关研究的重大意义。