title:Phosphorylation and ubiquitination of OsWRKY31 are integral to OsMKK10-2-mediated defense responses in rice
发现基因：(Oryza sativa) transcription factor gene OsWRKY31 is a key component in a MPK signaling pathway in�volved in plant disease resistance in rice.
生物学通路：OsMKK10-2的激活增强了对稻瘟病菌的抗性，并通过增加茉莉酸和水杨酸的积累和降低ἧ-3-乙酸水平来抑制生长。敲除OsWRKY31会影响OsMKK10-2介导的防御反应。OsMKK10-2和OsWRKY31在物理上相互作用，OsWRKY31被OsMPK3、OsMPK4和OsMPK6磷酸化。拟磷的OsWRKY31具有较高的dna结合活性，并增强了对M. oryzae的抗性。此外，OsWRKY31的稳定性通过环指E3泛素连接酶与WRKY 1（OsREIW1）相互作用而受到磷酸化和泛素化的调控。
How the OsWRKY31 physically interacts with OsMKK10-2 and
OsMPKs
目的：用OsMKK10-2和OsWRKY31分别与Gal4dna结合域（pBD诱饵载体）和激活域（pAD猎物载体）融合，检测OsMKK10-2和OsWRKY31之间的相互作用。
RES：OsMKK10-2和OsWRKY31在含有BD-OsMKK10-31质粒的酵母细胞上生长，证实了OsMKK10-2和OsWRKY31之间的相互作用。而OsMKK10-2与OsWRKY76.1或OsWRKY45之间没有相互作用，表明OsMKK10-2与OsWRKY31之间存在特定的相互作用。
实验：OsWRKY31、OsWRKY45、OsWRKY76.1和OsMKK10-2融合到Gal4激活域（猎物）或dna结合域（诱饵）。将适当组合质粒的结果引入酵母细胞，然后在不含Leu和Trp（-LW）或缺乏Leu、Trp、His和腺嘌呤（-LWHA）的合成辍学培养基中培养，并在镀后3d拍照。以含有AD-T7+BD-53和AD-T7+BD-Lam质粒的酵母细胞分别作为阳性对照和阴性对照。
目的：验证OsWRKY31和OsMKK10-2在植物中的相互作用
实验：将OsMKK10-2和OsWRKY31与分裂黄色荧光蛋白（YFP）的N端或c端融合，进行双分子荧光互补，35S：MKK10-2-YFPC和35S：WRKY31-YFPN质粒通过农杆菌介导的渗透，与核定位信号靶向dsRED（35S：dsRED-NLS）在本氏烟草叶片中共表达。
RES：YFP荧光检测表明MKK10-2-YFPC与WRKY31-YFPN相互作用
目的：确定发生的位置
最后实验结果：YFP和RED荧光信号的共定位表明，该相互作用只发生在本氏杆菌的细胞核中
实验：采用多色BiFC分析检测OsWRKY31、OsMPK3和OsMKK10-2KR（通过改变氨基酸Lys81生成的激酶死亡突变体）之间的复杂形成，因为OsMKK10-2导致本氏叶细胞死亡
结果：结果表明OsWRKY31可以与OsMPK3及其上游OsMKK10-2发生物理相互作用，形成三元配合物。
OsWRKY31被OsMKK10-2-OsMPK模块磷酸化
目的：为了研究OsMKK10-2是否能够激活OsMPKs和OsWRKY31的磷酸化
实验：首先分析了OsMKK10-2的自磷酸化活性，OsMKK10-2的氨基酸Arg203和Ser209被突变为Asp（OsMKK10-2DD）进行结构性激活
结果：尽管OsMKK10-2不包含典型的S/T-X5-S/T基序进行MKKK磷酸化。重组GST-MKK10-2DD-3myc蛋白有自磷酸化活性，野生型GST-MKK10-2-3myc有自磷酸化活性，而激酶死亡突变体GST-MKK10-2KR-3myc没有自磷酸化活性。
实验：使用Phos-tag凝胶法研究了OsMPK蛋白对OsWRKY31的磷酸化
结果：在GST-MPK3-3myc和GST-MPK4-3myc处理的样品中，磷酸化的GST-WRKY31-3标志蛋白的迁移明显延迟，而在仅用GST-MPK6-3myc、GST-MKK10-2-3myc或GST-MKK10-2DD- 3myc处理的样品中，没有发现明显的延迟条带。然而，当GST-MPK6-3myc与GST-MKK10-2-3myc或GST-MKK10-2DD-3myc联合加入时，GST-WRKY31-3标志显著磷酸化，表明OsMKK10-2激活OsMPK6是OsWRKY31磷酸化所必需的。
实验：检测了OsMKK10-2是否激活了植物中OsMPKs和OsWRKY31的磷酸化
结果：通过CRISPR/Cas9方法获得了地塞米松（Dex）诱导的MKK10-2-myc植株和OsMKK10-2（mkk10-2ko）、OsMPK3（mpk3ko）和OsWRKY31（w31ko）的敲除植株(补充图。S3).用右美托咪定或二甲亚砜（DMSO）处理水稻幼苗：以右美托咪定10-2-myc溶剂作为对照，并取样进行免疫印迹分析。使用抗ptepy抗体处理右美托咪定后检测到OsMPK6和OsMPK3的显著磷酸化，而在右美托咪定： MKK10-2 mpk3ko植株中，右美托咪定处理未能激活OsMPK3的磷酸化图2b，表明OsMPK3也是OsMKK10-2磷酸化级联下游的组成部分。此外，使用一种抗体检测OsWRKY31在Ser6位点的特异性磷酸化（抗w31ps6），与模拟处理相比，dex诱导的植株中OsWRKY31的磷酸化水平有所增加（图2B）。此外，在几丁质诱导的背景下，OsWRKY31在mpk3ko中积累减少，尽管磷酸化的OsWRKY31相对于总OsWRKY31的相对数量有所变化。此外，几丁质诱导的OsWRKY31在mpk3ko背景下的积累减少，尽管在不同的实验中发现磷酸化的OsWRKY31相对于总OsWRKY31的相对数量有所变化。
OsWRKY31 is a key player in OsMKK10-2-mediated
resistance against M. oryzae
目的：为了研究OsWRKY31在防御反应过程中是否作用于OsMKK10-2的下游
实验：将M. oryzae SZ菌株的孢子注入水稻植株(约3 mo-old)叶鞘中，收集新生长的叶片进行病害评价。mkk10-2ko和w31ko植株对M. oryzae SZ的敏感性高于中华17 (ZH17)，而过表达oswrky31的植株对SZ的敏感性低于对照ZH17。而在mkk10-2ko和mpk3ko背景中引入Ubi: fW31h显著降低了对M. oryzae的敏感性。
目的：为激活OsMKK10-2
实验：在接种前12 h喷洒x：10-2-10-2w31ko植株。Dex诱导的OsMKK10-2表达增强了植物对oryzae的抗性，但当Dex： MKK10-2 w31ko系中OsWRKY31基因被破坏后，抗性被消除（图3、C和D）。相反，敲除OsMPK3只能部分减弱Osmkk10-2对稻瘟病菌的抗性。综上所述，这些数据强烈表明OsWRKY31在osmkk10-2介导的广泛营养期的抗性中起关键作用。
在mkk10-2ko和mpk3ko背景中引入Ubi： fW31h，显著降低了对M. oryzae的敏感性。为激活OsMKK10-2，在接种前12h-2-0-2w31ko植株。Dex诱导的OsMKK10-2的表达增强了植物对M. oryzae的抗性，但当Dex： MKK10-2 w31ko株系中OsWRKY31基因被破坏后，抗性被消除。
OsMKK10-2 alters auxin distribution and accumulation
前情提要：系统发育分析表明，OsMKK10-2是拟南芥MKK10的同源物，与MKK7属于同一个D类群
目的：为了了解OsMKK10-2是否参与了生长素的运输
方法：测量了过表达OsMKK10-2的转基因植物黄化下胚轴中氚标记的IAA（3 H-IAA）的向碱性运动。右美托咪定处理12小时后，MKK10-2-myc植株下胚轴段3 H-IAA转运的∼降低到对照植株的60%，而右美托咪定： MKK10-2 w31ko和zh17对照植株的生长素转运水平相似（图4A）。与对照组相比，过表达oswrky31的下胚轴的向基性PAT被显著抑制，而mkk10-2ko片段的PAT被增强。
目的：为了进一步说明OsMKK10-2对生长素水平的影响
实验：将一个生长素应答报告株系与Dex： MKK10-2-myc植株杂交，生成DR5：GUS Dex： MKK10-2子代。为了观察生长素在体内的分布，我们从种子萌发早期就对用Dex或DMSO溶剂处理的幼苗进行GUS染色。右美托咪定处理24 h后，萌发种子上的GUS染色明显减少，OsMKK10-2蛋白诱导后，种子萌发过程中游离生长素水平下降。在5d龄幼苗中，右美托咪定处理也降低了叶片和主根上部的GUS活性，但增强了主根下部的染色。说明了生长素的不均匀分布也有一定的作用。
实验通路：黄素单加氧酶基因通过色氨酸依赖途径编码IAA生物合成中的速率限制酶（Bamotoetal.2007）。OsARF12和OsARF16是调节生长素响应基因的转录激活因子，影响生长素运输和根伸长（Qi等2012；Shen等2015）。在Dex诱导的Dex： MKK10-2-myc植株中，OsYUCCA1、OsARF12和OsARF16的表达水平降低（图4D）。综上所述，OsMKK10-2调节生长素稳态和信号转导。
目的：为了检测OsMKK10-2表达的可能生长表型
实验：将萌发的右美托咪定： MKK10-2-myc种子转移到含有不同浓度右美托咪定的半强度Murashige和Skoog（MS）培养基上。右美托咪定： MKK10-2-myc幼苗的根和胚芽生长，随着右美托咪定浓度的增加而被高度抑制(补充图。S8，A~C)，表明OsMKK10-2表达的升高与这些表型有关。此外，在Dex：MKK10-2-MKK10-2w31ko中，在w31ko背景下，其对根系生长的抑制作用减弱。KYOsWRKY31是OsMKK10-2下游的重要调控因子。
由于OsMKK10-2的激活促进了抗病性，抑制了生长素的运输和代谢，我们分析了与这些表型相关的基因的转录水平。右美托咪定处理后，不同Dex： MKK10-2-myc植株中OsMKK10-2的转录水平升高；而在右美托咪定： MKK10-2 w31ko系中，OsMKK10-2转录水平的增加被轻微抑制。
OsMKK10-2的激活增加了Dex： MKK10-2-myc中OsWRKY31的表达。而Ubi中OsMKK10-2转录本水平无明显变化，fW31h植株中，OsWRKY31转录本水平非常高。
生物学过程：茉莉酸（JA）诱导的丙烯氧化合酶OsAOS2是JA生物合成基因，被OsMKK10-2的激活显著诱导（图5C）。据报道，OsWRKY45在水稻sa介导的防御反应中发挥重要作用。在Dex： MKK10-2-myc植株中，OsWRKY45转录本水平上调了约3倍，这种增加需要功能性的OsWRKY31（图5D）。此外，在dex诱导的OsMKK10-2和Ubi： fW31h植株中，OsPR1a和OsPR1b的表达均升高。
并且OsPIN2编码PIN家族的生长素外排转运体，其过表达增强了生长素从芽到根的运输（Chen et al. 2012）。在我们的研究中，在Dex诱导的右美托咪定： MKK10-2-myc植株中，OsPIN2的表达受到强烈抑制（图5G）。相反，与对照组相比，Dex： MKK10-2-myc植株中属于生长素流入载体家族的OsAUX3的表达水平升高。
OsMKK10-2 and OsWRKY31 participate in PAMP regulation of defense and auxin pathways
检测了OsPIN2pro： GUS对几丁质的反应，并证实了在几丁质处理后，侧根原基和根尖的GUS染色减弱。同时，甲壳素处理减少了侧根原基的数量。对向碱性PAT的试验显示，几丁质或flg22的存在对水稻幼苗的PAT有显著的抑制作用。
生长素对使用OsPIN2pro： GUS和DR5：GUS植物的反应。OsPIN2pro： GUS的组织化学分析显示，IAA和MeJA处理显著抑制了初根顶端的GUS信号。
Phosphomimetic OsWRKY31 enhances cis-element-binding activity and disease resistance
目的：为了研究OsWRKY31磷酸化是否会影响其W-box结合能力
实验：通过电泳迁移率测定（EMSA）检测了OsWRKY31与不同W-box元素组合的探针的结合。重组OsWRKY31蛋白与OsPR1b启动子的探针具有不同的亲和力特异性相互作用；然而，在大多数WRKY转录因子中，OsWRKY31含有一个七蛋白基序，而不是更保守的WRKYGQK基序。
结果：OsWRKY31与BP22-f1（包含W-box的核心序列TGAC）的结合比BP22-f3（包含TTGAC）的探针更弱，表明OsWRKY31可能更倾向于与完整的W-box元件相互作用。此外，拟磷的OsWRKY31S6DS101D蛋白表现出更强的延迟带强度，而拟磷的OsWRKY31S6A和OsWRKY31S6AS101A的结合活性明显低于野生型蛋白
目的：研究OsWRKY31的磷酸化是否会影响其与W-box的结合能力
实验：通过电泳迁移率测定（EMSA）检测了OsWRKY31与不同W-box元素组合的探针的结合。重组OsWRKY31蛋白与OsPR1b启动子的探针具有不同的亲和力特异性相互作用；然而，在大多数WRKY转录因子中，OsWRKY31含有一个七蛋白基序，而不是更保守的WRKYGQK基序。OsWRKY31与BP22-f1（包含W-box的核心序列TGAC）的结合能力弱于BP22-f3（包含TTGAC）的探针，提示OsWRKY31可能更倾向于与完整的W-box元件相互作用。此外，与OsWRKY31相比，S6DS101D蛋白表现出更强的延迟带强度，而磷的OsWRKY31S6A和OsWRKY31S6AS101A与野生型蛋白的结合活性明显降低。
实验：利用Wbox： GUS报告基因检测本氏叶片中OsWRKY31及其磷酸化物的转活化活性。
结果：与OsWRKY31S6AS101A或GFP对照相比，OsWRKY31和OsWRKY31S6DS101D效应子的相对活性稳步增加（图7，C和D），并且通过添加几丁质处理增加了活性。
目的：为了研究OsWRKY31磷位点在植物中的影响
实验：在w31ko#14遗传背景下生成了OsWRKY31拟磷和拟磷植株（Ubi：W31S6DS101D-3旗w31ko：W31S6AS101A-3旗w31ko；缩写为W31DD-3旗w31ko和W31AA-3旗w31ko）。拟磷W31DD-3旗w31ko植株的抗性显著增加。
当检测OsWRKY31蛋白的丰度时，我们发现与OsWRKY31的转录水平相比，fW31h植株中OsWRKY31的积累水平较低，特别是在水培培养条件下（图5B）。在经几丁质处理的Ubi： fW31h植株中，观察到OsWRKY31蛋白的快速和瞬时诱导
与几丁质处理类似，OsWRKY31蛋白在Ubi： fW31h#2植株中及其磷酸化水平同时升高，MG132是一种蛋白酶体介导的蛋白降解抑制剂
目的：为了解释为什么W31DD-3标记w31ko和W31-3标记w31ko株系对M. oryzae表现出相似的抗性水平（图7、F和G），我们分析了各自转基因编码的蛋白水平。
发现：拟磷突变体OsWRKY31DD通过对感染前的OsWRKY31的比较，发现其丰度高于野生型OsWRKY31。稻瘟病菌SZ菌株在3h后，为病原菌感染的早期感染期，达到OsWRKY31DD水平。
目的：为了进一步证实OsWRKY31丰度与其磷酸化状态之间的关系实验：通过农渗透在本氏菌叶片中与OsWRKY31瞬时表达OsMPK3。表达35S：MPK3-myc的Ubi：W31-3标志的植物中OsWRKY31蛋白及其磷酸化水平高于35S：MPK3KR-myc或35S：GFP-myc（图8D），支持了OsWRKY31磷酸化有利于其蛋白积累的观点，与图2c中观察到的观点一致。OsWRKY31的增加可能是因为磷酸化活性OsWRKY31的增加触发了防御信号的巨大变化，并刺激了未磷酸化的OsWRKY31的高水平表达。综上所述，几丁质对OsWRKY31积累的快速诱导和在稻瘟病菌的早期侵染过程中表明，OsWRKY31在有效的防御反应中受到高度控制。
OsWRKY31 stability is regulated by ubiquitination
目的：我们寻找了E3泛素连接酶作为OsWRKY31的潜在交互作用子。一个环指E3泛素连接酶与WRKY相互作用，命名为OsREIW1，之前通过Y2H筛选获得。
实验：通过对植物对一组植物激素处理的反应的转录组学分析（Sato et al. 2013），我们发现OsREIW1与OsWRKY31共同调控(补充图。S15A).此外，通过下拉实验证实，OsWRKY31在酵母细胞中与OsREIW1蛋白相互作用，而与E3连接酶PUB6没有相互作用
重组GST-REIW1-3myc蛋白表现出自泛素化活性，而OsREIW1H56Y突变体没有酶活性。OsWRKY31被OsREIW1高度泛素化（图9D）。相比之下，拟磷的OsWRKY31DD的泛素化程度弱于拟磷的OsWRKY31AA和OsWRKY31
OsWRKY31DD的水平高于OsWRKY31植株相重组GST-REIW1-3myc蛋白表现出自泛素化活性，而OsREIW1H56Y突变体没有酶活性(补充图。S15C).OsWRKY31被OsREIW1高度泛素化（图9D）。相比之下，拟磷的OsWRKY31DD的泛素化程度弱于拟磷的OsWRKY31AA和OsWRKY31
与OsREIW1敲除（reiw1ko）植株相比，过表达OsREIW1或野生型ZH17植株的提取物中GST-WRKY31-3植株的旗帜降解速度更快
REIW1植株（Ubi： fW31h和Ubi： REIW1-3myc杂交后代）中OsWRKY31的丰度低于Ubi： fW31h reiw1ko植株（图9G）。值得注意的是，MG132处理后，Ubi： REIW1-3myc植株中OsWRKY31水平升高，而reiw1ko植株中31水平没有升高（图9G），表明OsWRKY31是OsREIW1通过26S蛋白酶体降解的靶点。检测了osreiw1相关植株对稻瘟病菌SZ的响应。OsREIW1的敲除突变体对真菌病原体的抗性增强，而Ubi： REIW1-3myc植株对SZ病原体的敏感性高于ZH17