单细胞转录组分析揭示了经典霍奇金淋巴瘤肿瘤微环境中的疾病定义性T细胞亚群

题目：Single-Cell Transcriptome Analysis Reveals Disease-Defining T-cell Subsets in the Tumor Microenvironment of Classic Hodgkin Lymphoma
发表期刊：Cancer Discovery (IF:39.4)
发表年份：2020-03

摘要

霍奇金淋巴瘤( Classic Hodgkin Lymphoma, cHL)的肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)是由不同类型的非恶性的免疫细胞和恶性细胞(HRS)组成的。细胞成分及其空间关系的特征对于理解TME中的 cross-talk和治疗靶向至关重要。作者对22个霍奇金淋巴瘤组织标本和5例健康对照淋巴结组织进行单细胞转录组测序，总共包含127000多个细胞，首次在单细胞水平揭示了霍奇金淋巴瘤特异性免疫微环境的表型。单细胞表达谱确定了一种新的霍奇金淋巴瘤相关T细胞亚群，该亚群高表达LAG3，确定该LAG3+T细胞群是免疫抑制环境形成的中介物质。微环境中免疫细胞的Multiplexed spatial assessmen评估也显示，MHC II类缺陷肿瘤细胞附近的LAG3+T细胞增加。这些发现为TME生物学提供了新的见解，并为霍奇金淋巴瘤的免疫检查点靶向提供了新的方法。

实验设计及质控

结果

1.单细胞水平的cHL特异性免疫微环境

总共22例cHL患者的淋巴结单细胞悬液，包括12例结节硬化（NS）亚型、9例混合细胞（MC）亚型和1例富含淋巴细胞亚型。同时还有5个健康供者的反应性淋巴结（RLN）进行了测序，作为正常对照）。总共得到127786个活细胞，每个细胞检测到的基因数目中位数是1203。合并了所有细胞（保活cHL和RLN）的表达数据，并进行了批量校正和标准化。最终确定了22个细胞簇(Figure 1A),包括 na?ve T-cell clusters, two CD8+ T-cell clusters, six CD4+ T-cell clusters, seven B-cell clusters, one macrophage cluster, one plasmacytoid dendritic cell cluster, and one progenitor cell cluster.大多数免疫细胞表型在cHL和RLN之间均有所重叠，一些特定的细胞簇主要来自cHL。

Figure 1 A and B

而且，与RLN相比，3个Treg 细胞群在cHL样本数目更多，比例更高(Figure 1 C-E)。

Figure 1 C-E

2.EBV状态对cHL免疫细胞亚群的影响

30%至40%的cHL与EB感染HRS细胞有关，EBV感染可以招募特定的Treg群体到cHL的TME中。于是比较了5个EB+和17个EB-样本，发现在EBV+cHL中，具有Th17特征的CD4+T细胞比例显著降低（Figure 1 F and G）。然而，两组之间的CD8+T细胞或Treg比例没有显著差异（Figure 1 F）。类似地，与cHL NS亚型相比，通常与EBV相关的cHL MC亚型的Th17比例较低(Figure 1 H)。

Figure 1 F and G

2.cHL特异性免疫亚群的单细胞图谱

Figure 1B 和D 表明，与RLN相比，cHL中的Tregs较多。于是将分析重点放在Treg亚群上。除IL2RA（CD25）和TNFRSF18（Figure 2A）等常见Treg标记物外，CD4-CD5-Treg亚群还高表达LAG3。然而，其他典型的Treg 细胞marker，如FOXP3在该亚群中表达较低，表明这些细胞可能是I型调节性（TrI）T细胞表型（图2B）。为了证实cHL中免疫细胞的表达模式，还使用多色IHC和IMC评估了所有cHL病例中胞面和胞内marker的表达。证实了CD4+T细胞上的LAG3和FOXP3蛋白质表达水平呈负相关。（Supplementary Figure 6 B and C）。

Supplementary Figure 6 B and C

为了进一步了解cHL TME中抑制性受体表达的特点，探索了单个T细胞之间的表达模式。发现有LAG3表达的细胞多来自Treg，有PD-1表达的细胞比较多来自非Treg的CD4+T细胞 (Figure 2 C). 有趣的是，CD8+T细胞（包括CTL）不是表达PD-1和LAG3的主要群体 (Figure 2 C and D)。这表明cHL中，CD4+T细胞群体对于免疫检查点调节的重要性。值得注意的是，每个抑制性受体在cHL的每个T细胞亚群中的作用具有特异性(Figure 2 E)

Figure 2 C

Figure 2 D and E

大多数LAG3+T细胞共表达CTLA4，CTLA4是一种更普遍的Treg标记，而PD-1则没有这种现象（Figure 2 F）。接着使用了 diffusion map algorithm分析所有CD4+T细胞亚群的分化状态。第一维度显示出naive T细胞开始到Tregs T细胞的分化轨迹结束的轨迹。LAG3+T细胞在该维度的远端富集，这说明这群细胞与代表终末分化特征的基因相关。与之前的报道一致，LAG3阳性的细胞增殖活性下降，抑制活性增强，与G2–M细胞周期和糖酵解特征基因相关。

Figure 2 F and G

3.cHL细胞上清能诱导LAG3+ T Cells增殖

接着研究了LAG3+T细胞的细胞因子表达水平。在CD4+T细胞中，LAG3+T细胞的细胞因子IL10、TGFβ和IFNγ的表达高于LAG3? T细胞（Figure 3 A）。这些特征与1型调节性T细胞的特征一致。

Figure 3 A

接着假设HRS细胞产生的细胞因子或趋化因子可能影响cHL的TME。评估了各种淋巴瘤细胞系的上清液对T细胞体外扩增的影响。活化T细胞14天后，流式证实，与弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞系上清液或仅培养基共培养的T细胞相比，与cHL细胞系上清液共培养的CD4+CD25+T细胞上表达的LAG3水平较高（Figure 3 B and C).

Figure 3 B and C

Luminex分析表明，与DLBCL细胞系相比，cHL细胞系上清液有更的细胞因子和趋化因子，包括TARC/CCL17、TGFβ和IL6，它们是已知的Treg迁移和分化增强剂（Figure 3 D）。与scRNA-seq结果一致，与CD4+LAG3-T细胞相比，CD4+LAG3+T细胞分泌的IL10和TGFβ数量显著增加（Figure 3 E）。值得注意的是，体外共培养后，CD4+LAG3+T细胞抑制CD4+T细胞的增殖，证实了LAG3+T细胞的免疫抑制功能（Figure 3 F）。

Figure 3 D-F

4.LAG3+T细胞和HRS细胞的空间评估

接下来，探究LAG3+T细胞和恶性HRS细胞之间的空间关系。病人样本的IHC显示，与RLN相比，cHL TME中富含LAG3+T细胞，并且在一部分cHL病例中，HRS细胞被LAG3+T细胞紧密包围（Figure 4 A）。单细胞分析结果提示，与MHC II类阳性的HRS细胞（n=16）相比，MHC II类阴性HRS细胞（n=6）的LAG3表达显著更高，但与EBV状态或组织学亚型无关（Figure 4 B)。对于CD4-Treg-C5亚群，与MHC II类阳性细胞相比，MHC II类阴性细胞中LAG3上调倍数最大（Figure 4 C）。

Figure 4 A-C

IHC表明，与MHC-II阳性的样本相比，MHC-II阴性样本LAG3+T细胞显著增加，FOXP3+T细胞减少（Figure 4 D）。多色IHC评估了HRS细胞和LAG3+CD4+T细胞之间的空间关系（Figure 4 E-G）。MHC-II阴性样本HRS周围区域的LAG3+T细胞密度显著增加，但与MHC-I状态、病理亚型或EBV状态均无相关性（Figure 4 E）。同样，在MHC-II阴性的cHL样本中，CD30+细胞（HRS细胞）与其最近的LAG3+T细胞之间的平均最近邻距离显著最短（Figure 4 F）。相反，在MHC-II阳性HRS细胞的样本中，围绕FOXP3+T细胞的HRS细胞数目较高（Figure 4 E），HRS细胞到FOXP3+细胞的最近邻距离也较短（Figure 4 F）。

Figure 4 E-G

为了进一步研究HRS细胞及其周围细胞之间的空间关系，使用IMC成像质谱流式方法，评估所有cHL病例中表面和胞内标记物的表达（这个技术允许在TME的空间背景下同时可视化35个蛋白质标记物）。与IHC分析一致，MHC-II阴性cHL样本有大量LAG3+CD4+细胞浸润，伴有较少的FOXP3+CD4+细胞（Figure 5 A）。相反，MHC-II阳性病例显示大量的FOXP3+CD4+T细胞和少量LAG3+CD4+T细胞。与MHC-II阳性cHL病例相比，MHC-II阴性cHL标本中HRS细胞与LAG3+T细胞之间的最近邻距离明显缩短。

Figure 5 A-C

##5.在验证队列中，TME中LAG3+T细胞的数量与MHC-II表达的缺失相关

接下来，使用一个独立队列来验证LAG3+T细胞存在的潜在预后价值。这队列包括166名患者，进行了ABVD方案治疗(阿霉素、博莱霉素、长春碱和达卡巴嗪）。与scRNA-seq的结果一致，他们发现与MHC-II阳性HRS细胞相比，MHC-II阴性HRS细胞的肿瘤组织中LAG3+T细胞的比例显著高于MHC-II阳性中的HRS细胞，但与EBV状态无关（Figure 5 B and C）。此外，LAG3+T细胞数量增加与DSS和OSS缩短相关(Figure S13 A and B)。，高比例的LAG3+T细胞（>15%）和CD68+肿瘤相关巨噬细胞(≥5%）通过多变量Cox回归分析确定为DSS的独立预后因素（MHC-II表达和IPP评分作为协变量量，Figure S13 C）。最后在一个独立复发性cHL患者队列中（这些患者在接受高剂量化疗后进行自体干细胞移植），同样发现，LAG3+T细胞的增多与不良的存活率相关，尽管未达到统计显著性，可能是由于样本量太少（Figure S13 D）。

Figure S13

##6.cHL中HRS细胞与LAG3+T细胞之间的Cross-talk
cHL中HRS细胞与LAG3+T细胞之间的串扰
为了研究HRS细胞与cHL微环境相互作用，接下来探索了从原发性霍奇金淋巴瘤样本的显微解剖HRS细胞生成的Affymetrix基因表达数据。发现了MHC阴性样本的细胞因子和趋化因子的表达水平较高（图6A）。IL6是唯一一个在MHC-II阴性HRS细胞中表达显著高于MHC-II阳性HRS细胞的细胞因子。在体外，IL6也可诱导CD4+LAG3+T细胞形成（Figure 6B），表明IL6可能在诱导cHL中的CD4+LAG3+T细胞中发挥作用。

Figure 6

为了研究LAG3+T细胞和MHC-II在HRS细胞的相互作用，在L-428 cHL细胞系中敲除CIITA基因（因为CIITA是MHC-II表达的主要调节因子），并验证了敲除CIITA基因细胞上MHC-II呈阴性状态（Figure S14A）。

Figure S14A

接下来，使用L-428上清液培养从外周血单个核细胞（PBMC）中分离诱导的LAG3+T细胞。将LAG3+T细胞分别与野生型L-428细胞和CIITA敲除L-428共培养，发现LAG3的表达量在MHC-II阳性的L-428细胞中下调，表明MHC-II可以跟LAG3直接相互作用负调控LAG3+T细胞(Figure 6C)。

Figure 6

7.去除LAG3+T细胞后，临床样本来源的T细胞被激活

为了证实LAG3+T细胞在cHL临床样本中的致病作用，从4名患者的细胞悬液中分离了CD4+LAG3+CD25+T细胞和剩余的T细胞。然后在体外将T细胞与CD4+LAG3+CD25+T细胞共培养之后，
观察到与LAG3+细胞群共培养的T细胞中的增殖受到抑制，而不与LAG3+细胞群共培养的T细胞中，细胞增殖明显增强，且细胞内细胞因子TNFα的表达显著增加。

总的来说，MHC-II阴性HRS细胞的免疫抑制微环境是高度“有序”的，部分细胞由CD4+LAG3+T细胞诱导产生，而CD4+LAG3+T细胞又由HRS细胞产生的细胞因子和趋化因子诱导（Figure 7）。综合所有这些结果，作者推断LAG3+T细胞和HRS细胞之间的串扰可能是cHL免疫逃逸的一个重要机制，对检查点抑制剂治疗的结果预测具有潜在意义，包括反应持久性和克服耐药性。

Figure 7

研究意义

由HRS细胞的细胞因子和趋化因子诱导的LAG3+T细胞在cHL的TME中起着重要的免疫抑制作用。重要的是，LAG3是正在进行的恶性淋巴瘤临床试验（包括cHL）中的癌症免疫治疗靶点。该研究提示去除LAG3+群体可以作为重新激活T细胞活性的一种手段。虽然目前数据没有证明LAG3+T细胞作为预后生物标记物的价值，尚需要其他队列的进一步验证，但在针对LAG3+T细胞及其细胞相互作用的治疗背景下，评估LAG3+T细胞作为预测性生物标记物的潜力至关重要。特别是，正在进行的针对CTLA4或CD25的LAG3靶向抗体和抗体-药物结合物的试验（将针对LAG3+细胞等）将允许进行这种评估。此外，对包括LAG3+T细胞和其他免疫细胞类型等免疫细胞相互作用生物学的进一步研究，可能有助于未来替代检查点抑制剂的治疗开发。