文献学习031--[sc+st]时空转录组揭示病毒性心肌炎的发病机制

1. Single-cell and spatial transcriptomics of reovirus T1L-infected neonatal mice hearts

Fig 1A：为了探究reovirus诱导的心肌炎的病理生理过程，作者对新生鼠灌胃给了T1L呼肠孤病毒和mock control。取了感染后d1, d4, d7, d10的小鼠（和四个时间点对应的mock，一共是8组）的心脏和回肠组织进行了单细胞和空间转录组测序。此外为了鉴定组织中reovirus的(非腺苷酸化)转录本，还在scRNA-seq library中做了一个病毒片段的hybridization-based enrichment。

Hybridization-based enrichment of viral fragments

这种比对病毒基因组的方法之前在新冠的文献里见到过单细胞测序揭示COVID-19严重性与呼吸道上皮和免疫细胞的相互作用相关

Fig 1B C：心脏组织单细胞一共得到31684个细胞，分为18个细胞群。空转得到8243个spatial transcriptomes。
Fig 1D：回肠组织一共得到7,695单细胞和8,027spots。
Fig 1E：这个图展示了检测到病毒基因组的细胞的类型和比例。在回肠中，检测到了13,100个病毒转录本，病毒载量在d1-d4逐渐降低。d1时，病毒感染的细胞主要是肠内分泌细胞，其次是肠细胞和杯状细胞。d4天时则变成了淋巴管细胞，提示病毒通过引流淋巴管进入血液循环，并近一步进入心脏。在心脏中，在392个细胞中共检测出了2762个病毒的转录本。心脏中d4天时开始出现病毒感染的细胞，主要是心内膜细胞和内皮细胞。d7时心脏中病毒阳性的细胞比例进一步增加，主要仍然是心内膜细胞和内皮细胞。病毒转录本数目在d10则出现下降，和体外病毒滴度测定相一致。在d7时，中性粒细胞，树突状细胞和抗原呈递细胞中也检测出了病毒，提示这些细胞可能作为病毒的carrier，促进病毒扩散。

Fig 1

Sup 1F 不同细胞在心脏的空间定位

2. Endothelial cells are primed with basal interferon response and play an important role in initiating host innate immune response

Fig 2A：为了探究感染后心脏组织中的早期转录差异，作者对d4心脏和mock心脏做了Differential Gene Expression Analysis (DGEA)。得到226个上调基因(logFC > 1.0, p-value < 0.01;??这个FC卡的这么高，得到的上调基因数，很少啊)，包括interferon-b pathway, interferon signaling和innate immune responses相关的基因。
Fig 2B：为了定量和比较不同细胞类型间的早期感染反应严重程度，作者使用上面筛选出来的226个上调基因计算了心脏不同时间点不同细胞的infection response score, IR。结果显示内皮细胞在各个时间点都有着最高的炎性反应评分，和Mock相比，内皮的感染反应评分增长也是最高的。
这个结果提示内皮细胞可能是机体抵御病毒感染的重要initiators。（不是很充分）
Fig 2C：空转的数据提示d4 d7心脏的IR评分都出现增加，主要出现在myocarditic region。
Fig 2D：由于mock小鼠的内皮细胞也有着最高的IR 评分，作者使用了Tabula Muris scRNA-seq mouse atlas的数据来查看这是否是在多种器官中存在的普遍现象。结果提示在多个器官中内皮细胞都具有最高的IR评分。
Fig 2E：随后作者使用同样的方法计算了回肠组织的差异基因，使用上调的基因计算了IR评分。在回肠组织不同细胞的IR评分中，肠细胞是最高的，其次是肠内分泌细胞。
Fig 2F：空间组学的数据则提示回肠中最高的IR评分出现在肠粘膜和绒毛。

这种先找整体的高表达基因，再把高变表达基因当成一个module，通过计算每个细胞类型的模块评分来看哪个细胞类型反应最大的思路很好啊，比之前读的单细胞测序揭示心衰患者循环免疫细胞的广泛变化里的Fig1 I那样子先找差异基因然后在不同细胞里面画基因的韦恩图感觉更优雅一点～

3. Cytotoxic T cells recruited by inflamed endothelial cells induce pyroptosis

Fig 3A B：为了进一步探究心脏内皮细胞的异质性，作者对9,786个心脏内皮细胞进行了重新聚类，得到四类细胞。
Fig 3C：亚群的差异基因分析提示D7 inflamed EC高表达趋化因子Cxcl9和Cxcl10。这两个趋化因子在趋化T细胞反应中起到重要作用。跟这个结果对应的，7天的t细胞也高表达了Cxcl9和Cxcl10的受体Cxcr3。此外内皮细胞还高表达MHC I类 (H2-D1，H2-K1) 和 MHC II类 (Cd74)分子，提示向T细胞的抗原呈递增强。
Fig 3D：Cxcl9^high内皮细胞的通路富集结果中也包含了白细胞粘连，T细胞活化，IL-8产生，细胞因子反应，TNF活化，IFNG活化等通路（见sup）。这些通路的活化也主要存在于myocarditic region。

前面的结果提示内皮细胞参与T细胞的活化和招募，因此作者下一步探究了T细胞的异质性。
Fig 3E F：作者对心脏中浸润的2205个T细胞进行了重新聚类，得到了4个亚群。包括一个Tn群，一个Th群和两个Tc群。
Fig 3G：差异分析结果提示Tc和Th细胞都高表达Cxcr3，还高表达Ifng, Ccl3, Ccl4, Ccl5, S100A4和S100A6，提示它们参与中性粒细胞招募和活化。Tc细胞在所有细胞中占比最高，还高表达Prf1, Gzma, Gzmb和Gzmk等颗粒酶依赖性胞吐作用相关的溶菌颗粒。
Fig 3H：通路富集结果中包含中性粒活化，抗原呈递，NFkB，TNF活化等pathway。
此外，死亡相关pathway的下游分子如Pycard, Acer2, Zbp1, Casp1, Casp4和Casp12也在Cxcl9^high内皮细胞高表达，提示细胞毒性淋巴细胞可能是引起inflamed内皮细胞死亡的原因。内皮细胞的通路富集也富集到了死亡相关的pathway(Supp Fig. 3F)。在前面的结果中，心脏中T细胞也主要存在于myocarditic regions和border区。结合Fig 3D和H的结果，在Cxcl9^high内皮细胞和Tc细胞中富集到的通路都主要存在于myocarditic regions，提示构成心脏血管网络的内皮细胞在驱动心脏适应性免疫中起到重要作用。
结合前面的结果，在reovirus-induced myocarditis中，血管内皮细胞受到了病毒的直接攻击和趋化来的Tc细胞的攻击。心脏中微血管网络的损伤可能进一步引起心脏血供受损，并且可能是进一步免疫反应介导的心肌细胞死亡的原因。

4. Spatially restricted gene expression in myocarditic tissue

心肌炎中心脏炎症反应的局灶性使得作者想要进一步去探究reovirus感染心脏的空间基因表达异质性。
Fig 4A：额 这个就是Fig 1C的那个图抠出来的吧
Supp Fig. 4A：作者计算了myocarditic regions的上调基因，发现很多免疫细胞的marker(T细胞的makrer Cd8a和Gzma，NK细胞的Nkg7，中性粒细胞的S100a8)，inflammation的marker (Cd52和Lyc62)，趋化因子和细胞因子(Ccl5, Ccl2, Cxcl9和Cxcl10)的高表达。对应的单细胞数据提示Ccl5主要是DC细胞表达，Ccl2主要是成纤维细胞表达，Cxcl9,10主要是内皮细胞表达。
Supp Fig. 4B：Ccl2的受体Ccr2主要在巨噬细胞表达，和既往报导相一致，提示巨噬细胞主要由成纤维细胞趋化而来。
Supp Fig. 4C：border zones的上调基因。

Fig 4B：对myocarditic regions和border zones的空间差异基因中还存在其他有意思的基因，包括Timp1, AW112010, Clu, Ankrd1, Gm4841和Ctss。
Supp Fig. 4D：单细胞数据提示Timp1主要在inflamed fibroblasts中表达。Timp1是MMP(参与细胞外基质的降解)的天然抑制剂。后面几个基因也是挨个解释了一下意义以及跟心肌炎的联系
Supp Fig. 4E：border zones上调基因的富集结果，富集到TNF, IL-1, NFkB等信号通路。

Fig 4C, Supp Fig. 1F：为了进一步理解免疫细胞浸润对myocarditic regions周围细胞类型组成的影响，作者定量了不同细胞在myocarditic region, border区和其它心室组织中的比例变化，发现Cxcl9^high内皮细胞，Ccl2⁺成纤维细胞，T细胞，DC和NK细胞在myocarditic regions增加，相应的，心肌细胞比例下降。
Supp. Fig. 4G-4H：为了进一步理解Ccl2⁺成纤维细胞，作者对成纤维细胞进行了进一步的聚类分群。得到了4个群。
Supp. Fig. 4I：Ccl2⁺成纤维细胞表达高水平的MHC I类分子(H2-D1 and H2-K1)，粘附分子Vcam1和Icam1，和其它基因比如Serpina3g, C3和Ms4a4d。此外这些成纤维细胞也高表达Casp1和Casp4，提示存在in response to cytotoxic T cells的焦亡反应。

Fig. 4D-E：为了探究心脏炎症浸润对心肌细胞的影响，作者把心肌细胞也单独提出来做了分群。得到了4个群。从右面的图可以看到，d7 infected的心肌具有比较特殊的转录特征，d4 d10infected的心肌则和mock聚在一起。
Fig. 4F：为了探究border区心肌的转录特征，作者把心肌细胞marker和border区marker取了个交集，得到31个基因。
Supp Fig. 4F：31个基因中包括Gm4841, Gm12185, Mt1, Mt2, Ankrd1和Nppb。Gm4841和Gm12185是干扰素诱导基因，Mt1和Mt2在缺血性心肌病小鼠中可以调节炎症，参与心肌重塑。Ankrd1是一个心肌存活因子，在晚期自发肥心的病人心脏中上调。

这些结果提示组织损伤主要存在于myocarditic regions，而border区则存在活跃的重塑，也提示着使用空间组学研究病毒性心肌炎的重要性。

Fig 4

Supp Fig. 4

5. Reduced adaptive immune cell infiltration associated with reovirus K287T mutant

最近报道了一种reovirus的变异株T1L S4-K287T (K287T)¹，这个变异株在编码外衣壳蛋白sigma-3的S4基因上有一个点突变，这个蛋白是一个双链RNA结合多功能蛋白，可以促进病毒蛋白的合成，帮助病毒进入细胞和组装。K287T可以感染心脏但是和WT相比它产生的病毒滴度很低，并不引起心肌炎。
Fig. 5A, Supp Fig. 4J：为了验证前面的发现，作者额外对K287T细胞感染后d4, d7和d10的心脏进行了单细胞测序。得到16771个细胞，随后作者把这部分数据和前面的数据做了整合。绝大多数K287T感染的细胞类型都可以和前面WT病毒感染的细胞类型聚在一起。
Supp Fig. 4K L：病毒转录本定量的结果提示，这种变异株病毒在d4的时候在心脏中的病毒载量和T1L差不多，但d7,d10时就显著减少。
Fig. 5B：随后作者比较了K287T和WT病毒感染后心肌细胞类型的早期宿主反应。（跟Fig2一样计算的d4的infection response score）结果提示不管是WT还是K287T病毒，内皮细胞的感染反应评分都是最高的。
Fig. 5C：作者比较了K287T和WT病毒感染后心脏中的细胞比例，结果提示K287T感染后d7的心脏中Cxcl9^high内皮细胞和各种免疫细胞都出现下降。
这些结果提示尽管感染的是K287T病毒，心脏内皮细胞仍然存在明显的固有免疫活化，但是病毒复制在大多数细胞中都下降。d7之后，随着病毒逐渐在细胞中被清除和较弱的适应性免疫应答的活化，K287T感染的心脏出现了非心肌炎表型。

整体上得到的病理生理机制是：
呼肠孤病毒在进入肠道1d之后，感染肠道上皮的内分泌细胞和肠细胞，这些细胞出现了明显的固有免疫反应以抑制病毒复制。病毒随后感染肠道淋巴管细胞(d4)，并通过肠道引流淋巴管进入血液，随后定植在心脏。心脏内皮细胞是最早对病毒起反应的细胞(d4)，出现了明显的固有免疫反应的活化。inflamed EC释放趋化因子Cxcl9和Cxcl10，趋化Tc细胞，并通过上调MHC I类和II类分析增强向T细胞的抗原呈递。趋化而来的Tc细胞可以诱导心肌组织焦亡。

分析主要是用Scanpy做的，整合单细胞和空转数据用的scvi-tools包的Stereoscope反卷积算法。做通路富集用的是gseapy，python版的gsea。

这篇文章，测了这么多数据，这么分析感觉有点浪费。但是不管分析的怎么样，单细胞+空间转录组的优势还是非常明显的。

参考文献：
1: The multi-functional reovirus 3 protein is a virulence factor that suppresses stress granule formation and is associated with myocardial injury. PLOS Pathog. 17, e1009494 (2021).