单细胞入门-读一篇scRNA-seq综述
文章信息今天分享的这篇文章于2019年10月9日发表在期刊Nature上,文章题目为:Decoding human fetal liverhaematopoiesis 。DOI号为:https://doi.org/10.1038/s41586-019-1652-y.
** 摘 要 **
通过10x Genomics 和 Smart-seq2单细胞测序平台对不同胎龄的14个胎肝样本、7个皮肤样本、3个肾脏样本、3个卵黄囊样本进行测序,获得了138,575个胎儿肝脏细胞及约74,000个皮肤,肾脏和卵黄囊细胞的单细胞转录组谱。推断了造血干细胞/多能祖细胞(HSC/MPP)的发育轨迹,定义胎肝造血过程中红系、淋系及髓系各个阶段的造血细胞,首次发现了胎儿皮肤中存在成红前体细胞,卵黄囊中存在肥大细胞,NK细胞及固有淋巴细胞前体细胞。随着妊娠的进展,胎肝HSC/MPP分化成为红细胞的比例降低,髓系及淋系的比例增高,与此同时HSC/MPP的分化潜能也发生了变化。
方法及分析概览
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样品:共收集17个胎儿标本,包括14个肝脏样本、7个皮肤样本、3个肾脏样本、3个卵黄囊标本,其中皮肤、肾脏被称为非淋巴组织(non-lymphoid tissues,NLTs)。样品详细信息如下:
建库测序:10x Genomics样本通过3’ v2 试剂及 V(D)J Reagent Kits建库后通过Illumina HiSeq 4000 测序;Smart-seq2样本通过Illumina Nextera XT kit (Illumina)测序。
数据上游分析:10x Genomics 测序数据通过Cell Ranger软件进行的比对及定量,参考基因组为GRCh38 人类参考基因组。Smart-seq2 测序数据通过STAR软件进行比对。使用htseq-count(v.0.10.0)计算基因的read计数。
质量控制:除去表达< 200个基因且线粒体基因>20%的细胞,除去少于3个细胞中表达的基因。用Scrublet去除Doublets。最终获得了138,575(n = 14)个胎儿肝脏细胞(使用Smart-seq2分析了1,206个细胞),54,690(n = 7)个皮肤,9,643个肾脏(n = 3)和10,071个卵黄囊(n = 3)细胞。10x Genomics平均每个细胞检测到约3,000个基因,使用Smart-seq2平均检测到约6,000个基因/细胞。
降维、聚类及细胞定义:应用Seurat包(v2.3.4)进行数据标准化,scaledata, variable gene detection,PCA、TSNE、UMAP降维,Louvain graph-based 聚类。细胞定义通过经典marker及DEG。胎肝细胞聚类又加用了两种聚类方法:agglomerative clustering及Gaussian Mixture,然后用Rand指数衡量三种聚类方法之间的一致性。细胞定义完后,通过胎肝数据训练support vector machine (SVM)来构建细胞类型分类器,之后用SVM细胞分类器来定义smart-seq2数据的细胞类型。
样本整合:相同组织样本之间整合用Harmony,不同组织样本之间的整合用Merge (Seurat函数)。kBET衡量批次效应。
下游分析:通过比较FDG,PAGA和diffusion-map推测发育轨迹。使用Monocle2中的DifferentialGeneTest函数计算伪时变化的基因。CellPhoneDB推断细胞之间相互作用。
功能验证:免疫组化、免疫荧光、HSC/MPP 培养。
主要结果
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1.构建了胎儿肝细胞图谱
Fig. 1a 实验流程
Fig. 1b 胎儿肝脏细胞图谱
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Fig. 1c 各妊娠阶段中每个谱系细胞的比例,胎肝主要以红系造血为主,但随着胎龄的增加,红系比例下降,髓系及淋系比例增加。
2. 细胞类型鉴定
Fig. 2a 展示胎肝各种细胞类型的marker,*表示后续用于流式分选细胞鉴定的marker。
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Fig. 2b 通过选定的marker进行流式分选后,Giemsa染色鉴定细胞类型。
3. 胎肝及非淋巴组织的造血
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Fig. 3a FDG图展示所有的造血细胞,可看到从HSC/MPP向三系的分化轨迹。
- Extended Data Fig. 3a 巨核细胞、肥大细胞、成红细胞有共同的前体细胞MEMP (megakaryocyte–erythroid–mast cell progenitor)。分化过程中动态调节的基因不同,红系谱系中的TAL1和KLF1,巨核细胞谱系中的F11R,PBX1和MEIS1,肥大细胞分化中的HES1。
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Fig. 3b 从卵黄囊到肝脏,红细胞血红蛋白基因表达以及从原始血红蛋白HBZ和HBE1表达到胎儿血红蛋白(HBA1和HBG2)表达的时间变化。
- Extended Data Fig. 3e 肥大细胞,巨核细胞和红系谱系细胞在肝、卵黄囊、皮肤、肾脏中均显示出较高的关联性。
- Extended Data Fig. 3d 皮肤MEMPs表达了一些早期的成红细胞基因,包括MYL4,表明这些细胞可能充当皮肤中的红细胞祖细胞,具有造血功能。
4. 胎肝和非淋巴组织的淋系细胞生成
- Fig. 4a & 4b 胎肝及非淋巴组织淋系细胞展示。在胎肝中发现了淋系两个方向分支,NK-T-ILC及B系。与肝脏和卵黄囊相比,非淋巴组织中存在Pro-B,pre-B和B细胞,但缺少HSC / MPP和pre-B前体细胞。
- Extended Data Fig. 5h & 5i NLT中的早期淋巴/ T淋巴细胞,NK细胞和ILC与肝脏相比相同的基因表达趋势。然而,趋化因子(XCLI和CXCL8)和细胞毒性颗粒(GNLY)基因的组织特异性表达表明,在皮肤和肾脏中发生了NK细胞的成熟和组织适应性。NLT中的ILC前体细胞缺乏其成熟后代ILC1,ILC2和ILC3的全套特征标记和转录因子。
- Extended Data Fig. 5a 根据PAGA, NK细胞(表达NCAM1,CD7,IL2RB和CD3E)和ILC前体(表达KIT,KLRB1,IL7R和RORC)在淋巴分支中具有共同的起源。
- Extended Data Fig. 5e HSC / MPP到B细胞分化过程中动态变化的基因包括SPIB,SP100和CTSS。
5. 髓样细胞组织分布特征
- Fig. 5a & Fig. 5b 胎儿肝脏,胎盘和卵黄囊的HSC / MPP,髓系祖细胞,单核细胞和巨噬细胞的FDG图。
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Extended Data Fig. 6a & 6b. DC分化涉及CLEC11A,BATF3和ID2的动态调节,而单核细胞分化涉及S100A8 / A9,FCGR1A / 2A和S100A12的动态调节。浆细胞样DC(pDC)前体从早期髓样前体和pre-B前体细胞分化而来,与最近在小鼠中相关研究结果一致。
6. HSC/MPP分化潜能随胎龄变化
Fig. 6a & 6b FDG展示各个阶段的HSC/MPP。根部的HSC表达CLEC9A, HLA-DRA及最高水平的原始基因如MLLT3,为多能的LT-HSC。
Fig.6c-e 来自CD34 + CD38-CD45RA- HSC / MPP的单细胞培养产生单能和多能的细胞群体。含有红系细胞的细胞群明显减少,而含有NK细胞和B细胞的细胞群则随着胎龄的增加而增加。胎龄小于9周时,无含B细胞的群体产生,提示这一阶段B细胞在胎肝中尚未分化。
Fig 6f-6g胎肝HSC / MPP G0期的比例随着胎龄的增加而增加,表明HSC逐渐趋于沉默状态。与脐带血及骨髓相比,胎肝HSC / MPPs显示编码热休克蛋白(HSPA1A)的基因表达较高,可能用于维持基因组和蛋白质组完整性,而MHC-1(HLA-B)含量较低,表明与抗原呈递能力较低。
总结
文章从单细胞水平,较为全面的构造了胎儿肝脏造血图谱,不仅推测出HSC/MPP向三系的分化轨迹,同时发现了HSC/MPP内部的细胞异质性及成熟度的变化,为研究人类其他器官及组织的发育轨迹提供了理想模板。
转自单细胞天地